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    BCA蛋白定量檢測試劑盒

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    貨號:
    S0921K45
    產品規格:
    1000
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    產品詳情 操作說明 注意事項

    產品簡介

    目前最常用的蛋白濃度定量檢測方法有兩種,即Bradford法和BCA法。BCA法定量檢測蛋白的基本原理是基于雙縮脲反應,即在堿性條件下,Cu2+被蛋白質還原成Cu+,隨后Cu+與BCA(Bicinchonic acid,一種顯色劑)發生螯合反應,每兩分子BCA螯合一個Cu+,生成紫色的水溶性復合物,該物質在562 nm處有最高吸收值,且顏色深淺與蛋白質濃度一定范圍內成正比,因此可用于蛋白質的定量檢測,蛋白濃度在50-2000 μg/mL濃度范圍內有較好的線性關系。

    本方法不受絕大部分樣品中化學物質的影響,可以兼容樣品中高濃度的去垢劑,包括濃度高達5%的SDS,5%的Triton X-100,5%的Tween-20、60、80等。但螯合劑和高濃度還原劑會影響檢測結果,需確保樣品中無EGTA,EDTA濃度低于10 mM,DTT低于1 mM,β-巰基乙醇低于1 mM。


    儲存與運輸

    整套試劑可常溫運輸;蛋白標準品(BSA)4℃保存,有效期12個月。配制成蛋白標準溶液后需-20℃保存,并在6個月內使用。其余試劑常溫保存,有效期12個月。


    操作步驟

    1. 配制蛋白標準貯備液:取1 mL蛋白標準配制液加入到蛋白標準品(BSA)蛋白標準管中,將25 mg蛋白標準品完全溶解,即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標準貯備液。配制成的蛋白標準溶液可-20℃長期保存。

    2. 配制蛋白標準工作液:取適量25 mg/mL蛋白標準貯備液,用PBS或生理鹽水稀釋50倍,得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標準工作液。注意稀釋時按照10倍梯度方法稀釋,確保稀釋準確。

    3. 繪制標準曲線(酶標儀法):將蛋白標準工作液分別按0,1,2,4,8,12,16,20 μL加到96孔板中,然后用PBS或生理鹽水依次加20,19,18,16,12,8,4,0 μL將上述梯度工作液補足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0,25,50,100,200,300,400,500 μg/mL的梯度曲線。

    4. 準備待測樣品:將待測的蛋白樣品進行適當稀釋(可通過預實驗檢測,使樣品蛋白濃度在標準曲線范圍內,確保檢測結果可信),按照每個樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標準品用相同溶液稀釋。

    5. 配制BCA顯色工作液:將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻,得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存,24 h內使用。每個待測樣品需200 μL,建議按需配制,避免浪費。

    6. 檢測:向標準曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL,充分混勻(可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s),37℃反應30 min后,以標準曲線0號做參比,在562 nm波長下比色測定,記錄各孔吸光度值。(注:也可以在室溫反應2 h,或60℃反應30 min。如果蛋白濃度較低,建議置于60℃反應)

    7. 計算:以標準曲線中梯度蛋白含量(μg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪出標準曲線。根據所測樣品的吸光值,在標準曲線上即可查得相應孔中待測樣品的蛋白濃度(μg/mL),再乘以樣品稀釋倍數即為待測樣品實際蛋白濃度。


    注意事項

    1. BCA法測定蛋白濃度受溫度和時間的影響較大,吸光度值會隨著時間的延長或溫度升高而變化,如果不能精確控制顯色反應的時間和溫度,建議每次測定都需要做標準曲線。

    2. 在進行蛋白標準貯備液的配制時,需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標準工作液時建議10倍梯度稀釋,不要一次稀釋50倍,以免產生較大誤差。

    3. 為保證蛋白的精確定量,樣品的提取和蛋白標準品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液,同保證兩者檢測條件一致。如果緩沖液本身就有較高的背景值,建議使用其他的方法測定。

    4. 操作時請穿實驗服,并佩戴一次性手套。

     

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