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    TMR (red) Tunel Cell Apoptosis Detection Kit

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    貨號:
    FKU0169
    產品規格:
    50T
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    產品詳情 操作說明 注意事項

    產品描述

    細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的階段性過程。染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300 kb的大片段,然后大約30%的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內切酶作用下,在核小體單位之間被隨機切斷,形成180-200 bp核小體DNA多聚體。因此在細胞凋亡晚期,DNA會被降解為180-200 bp的片段,斷裂的基因組DNA上暴露出大量的3'-OH末端。末端脫氧核糖核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)是一種不依賴于模板的DNA聚合酶,可以催化脫氧核苷酸結合到斷裂的DNA分子3'-OH末端。因此TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)細胞凋亡檢測試劑盒可以用來檢測組織細胞在凋亡晚期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是在TdT酶的作用下,在基因組DNA斷裂時暴露出的3′-OH末端摻入四甲基羅丹明-dUTP(Tetramethyl-Rhodamine-5-dUTP,TMR-5-dUTP),從而可以用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測(TMR激發520-560 nm,發射570-620 nm)。本試劑盒應用范圍廣,適用于石蠟組織切片,冰凍組織切片、細胞爬片、細胞涂片等的細胞凋亡檢測。



    儲存與運輸

    冰袋(wet ice)運輸;

    本試劑盒儲存在-20℃,TMR-5-dUTP Labeling Mix需避光儲存于-20℃,有效期12個月。


    實驗前準備

    1. PBS磷酸鹽緩沖液;

    2. 固定液:溶于PBS的4%多聚甲醛,pH 7.4;

    3. 破膜液:溶于0.1%檸檬酸鈉的0.1% Triton X-100;

    4. 配制含2% Triton X-100的PBS;配制含1% Triton X-100及5 mg/mL BSA的PBS;

    5. 如需染核,需自備DAPI(2 μg/mL)或PI(1 μg/mL);

    6. 如需陽性對照實驗,需自備DNase I;

    7. 如果用流式細胞儀,自備PI染液和RNase A(DNase free)

    8. 操作時請穿實驗服,佩戴一次性手套。


    操作步驟

    一、樣品準備

    A. 石蠟包埋組織切片

    1. 室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5-10 min,重復2-3次;然后無水乙醇浸泡5 min,重復2次;最后用梯度乙醇(85%、75%)、雙蒸水各浸泡1次,每次5 min;

    2. 用PBS輕輕潤洗切片,并去掉樣本周圍多余液體;使用組化筆沿組織外圍輪廓畫一個與組織間隔2-3 mm的小圈,便于下游通透性處理和平衡標記操作;在實驗過程中,切勿讓樣品干燥,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤;

    3. 配制Proteinase K工作液:按1:9體積比,用PBS作為稀釋液來稀釋Proteinase K(200 μg/mL)原液,使其終濃度為20 μg/mL;

    4. 每個樣本上滴加100 μL上述Proteinase K工作液,完全覆蓋組織,37℃孵育20 min;

    (注:Proteinase K處理主要有助于組織和細胞后續步驟的染色試劑通透,其孵育時間過長過短都會影響后續標記效率,得到更好的結果,可以優化Proteinase K孵育的時間)

    5. 用PBS溶液浸潤清洗樣本3次,每次5 min(Proteinase K需洗滌干凈,否則會干擾后續的標記反應)。處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤;

    6. (可選步驟)去掉樣本上多余的液體,將適量破膜液滴加到組織上,充分浸潤組織,室溫處理20 min;破膜處理完成后同樣的用PBS溶液潤洗樣本3次,每次5 min;處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

    B. 組織冰凍切片

    1. 將玻片浸沒在4%多聚甲醛溶液(溶于PBS)中固定,室溫下孵育10-15 min;

    2. 片子從固定液中取出后,通風櫥中自然晾干;

    3. 將玻片放入純水或PBS中潤洗,去掉玻片上殘存的固定液;

    4. 用組化筆沿著組織外圍輪廓畫一個與組織間隔2-3 mm的小圈,便于下游通透性處理和平衡標記操作;在實驗過程中,切勿讓樣品干燥,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤;

    5. 配制Proteinase K工作液:按1:9的比例,用PBS作為稀釋液來稀釋Proteinase K(200 μg/mL)原液,使其終濃度為20 μg/mL;

    6. 每個樣本上滴加100 μL上述Proteinase K工作液,使其被全部覆蓋,室溫孵育10 min;

    (注:Proteinase K處理主要有助于組織和細胞后續步驟的染色試劑通透。其孵育時間過長過短都會影響后續標記效率,未得到更好的結果,可能需要優化Proteinase K孵育的時間)

    7. 用PBS溶液潤洗樣本2-3次,去掉多余液體(Proteinase K需洗滌干凈,否則會干擾后續的標記反應),處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤;

    8. (可選步驟)將適量破膜液滴加到組織上,充分浸潤組織,室溫處理20 min,破膜處理完成后同樣的用PBS溶液潤洗樣本,去掉多余液體,處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

    C. 細胞爬片

    1. 在Lab-Tek載玻片小室(Chamber Slides)上培養貼壁細胞,在凋亡誘導處理之后,用PBS輕輕潤洗2遍載玻片;

    2. 向每個載玻片小室中加入適量的4%多聚甲醛溶液(溶于PBS)固定,室溫下孵育20 min;

    3. 去掉固定液,加入PBS清洗3次,每次5 min;

    4. 每個樣本浸于破膜液中,室溫孵育5 min進行通透處理;

    5. 在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次;

    6. 輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

    D. 細胞涂片

    1. 以約2×107個細胞/mL的濃度將細胞重懸于PBS中,吸取50-100 μL細胞懸液滴于防脫玻片上,使用一片潔凈的載玻片輕柔涂開細胞懸液;

    2. 將玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中,固定細胞,在4℃放置25 min;

    3. 將玻片浸入PBS中,室溫放置5 min浸洗,重復一次;

    4. 輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體,用組化筆沿著細胞外圍輪廓畫一個小圈,便于下游透性處理和平衡標記操作,在實驗過程中,切勿讓樣品干燥;

    5. 每個樣本浸于破膜液中,室溫孵育5 min進行通透處理;

    6. 在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次;

    7. 輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體,處理后的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。


    二、DNase I處理陽性對照實驗(可選步驟)

    在樣本通透處理后,用DNase I處理樣本來準備陽性對照。

    1. 將100 μL 1×DNase I Buffer(配制方法:取10 μL 10×DNase I Buffer,然后加入90 μL去離子水混勻)滴加到已通透的樣本上,室溫孵育5 min;

    2. 輕輕去掉多余液體,加入100 μL含有DNase I(20 U/mL)的工作液(配制方法:取10 μL 10×DNase I Buffer,然后加入2 μL DNase I,再加入88 μL去離子水混勻),室溫孵育10 min;

    3. 輕輕去掉多余的液體,并將載玻片在裝有PBS的染色缸中徹底洗3-4次。

    (注:陽性對照載玻片必須使用單獨的染色缸,否則陽性對照載玻片上殘留的DNase I可能會在實驗載玻片上引入高背景)


    三、標記與檢測

    1. 平衡:每個樣本滴加50 μL Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區域,室溫孵育10 min;

    2. 標記液配制:在冰上解凍TMR-5-dUTP Labeling Mix和Equilibration Buffer,并按照Recombinant TdT enzyme:TMR-5-dUTP Labeling Mix:Equilibration Buffer=1 μL:5 μL:50 μL(1:5:50)比例混合足夠用于所有實驗的TdT孵育緩沖液,具體實驗使用試劑的體積可以根據玻片的大小進行適當等比例調整;

    3. 陰性對照體系:準備一份不含Recombinant TdT enzyme的對照TdT孵育緩沖液,用ddH2O替代;

    4. 標記:盡量去掉平衡的Equilibration Buffer,然后在每份組織樣本上加入56 μL TdT孵育緩沖液,在37℃孵育1 h;注意不能干片,載玻片要避光;

    5. 立即用PBS潤洗組織樣本,清洗4次,每次5 min;

    6. 用濾紙輕輕擦掉樣本周圍的PBS溶液;

    7. 核染色:樣本在染色缸中染色,在黑暗中將載玻片浸入裝有DAPI溶液(用PBS新鮮配制并稀釋)的染色缸,室溫放置8 min;

    8. 封片:樣本染色完成后,用PBS清洗組織樣本3次,每次5 min,然后輕輕去掉多余液體,滴加抗熒光淬滅封片劑封片;

    9. 鏡檢:立即在熒光顯微鏡下分析樣本,載玻片注意避光,DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成藍色,只在凋亡的細胞核中才有TMR-5-dUTP摻入而定位的紅色熒光。


    四、利用流式細胞術檢測懸浮細胞

    1. 將待檢測細胞用PBS清洗兩次,4℃離心(500 g)然后重懸在500 μL PBS中;

    2. 固定:向樣品中加入5 mL 1%用PBS配制的多聚甲醛溶液,固定細胞,冰上放置20 min;

    3. 細胞在4℃,300 g離心10 min,去上清并用5 mL PBS重懸兩次,最后用500 μL PBS重懸細胞;

    4. 通透:向樣品中加入5 mL冰上預冷的70%乙醇,-20℃孵育4 h,通透細胞;

    (注:細胞也可用破膜液室溫5 min進行通透

    5. 細胞用300 g離心10 min后用5 mL PBS重懸,再次離心后用1 mL PBS 重懸;

    6. 平衡:轉移約2×106個細胞至1.5 mL的微量離心管,300 g離心10 min,去上清,并用80 μL Equilibration Buffer重懸,室溫孵育5 min;

    7. 標記液配制:在冰上解凍TMR-5-dUTP Labeling Mix和Equilibration Buffer,并按照Recombinant TdT enzyme:TMR-5-dUTP Labeling Mix:Equilibration Buffer=1 μL:5 μL:50 μL(1:5:50)比例混合足夠用于所有實驗和可選陽性對照反應的TdT孵育緩沖液;

    8. 標記:細胞用300 g離心10 min,去上清將沉淀重懸在56 μL TdT孵育緩沖液中,37℃孵育1 h,避光。每隔15 min用微量移液器輕輕重懸細胞;

    9. 反應完成后加入1 mL 20 mM EDTA終止反應,用微量移液器輕柔混勻;

    10. 300 g離心10 min,去上清并將沉淀重懸在1 mL破膜液中,其中含5 mg/mL BSA,重復洗2次;

    11. 核染色:300 g離心10 min,去上清并將細胞沉淀重懸在0.5 mL DAPI溶液中,其中包含250 μg無DNA酶的RNase A,在黑暗中室溫孵育細胞30 min;

    12. 上機檢測:流式細胞儀分析細胞,DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞核均染成藍色,只在凋亡的細胞核中才有TMR-5-dUTP摻入而定位的紅色熒光。


    五、實驗流程簡圖


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