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    T7 High Yield Transcription Kit

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    貨號:
    M0k942118
    產品規格:
    50T
    購買數量:
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    產品詳情 操作說明 注意事項

    產品信息

    產品名稱

    規格

    T7 High Yield

    Transcription Kit

    50T

    產品簡介

    本試劑盒是利用T7 RNA Polymerase,以含有T7啟動子的線性化質粒DNA、PCR產物或合成的DNA為模板,以NTP為底物,在體外轉錄合成RNA。本試劑盒優化了RNA體外轉錄反應體系,可以簡單快速獲得大量的RNA分子,如果轉錄時在底物中加入修飾的核苷酸,可以制備生物素或染料標記的RNA。本試劑盒主要用于體外翻譯、RNase保護實驗、雜交探針標記、RNA剪切等生物實驗。在反應體系中1 μg的模板投入量可以產生大于100 μg的RNA,適用于制備長度100-5000 nt的RNA。



    儲存與運輸

    冰袋(wet ice)運輸;-20℃保存,12個月有效。


    組成

    Component


    T7 RNA Transcription Enzyme Mix

    200 μL

    5×T7 Transcription Reaction Buffer

    250 μL

    25 mM NTP Mix

    100 μL

    DNase I

    50 μL

    Nuclease Free Water

    1 mL

    Control Template (0.5 μg/μL)

    10 μL

    說明書

    1份


    操作步驟

    1. 模板準備:

    a. 以T7啟動子的質粒為模板:為了得到特定長度的RNA,質粒模板必須完全線性化(需要純化后作為模板),且線性化的質粒確保雙鏈為平末端或5’突出端(避免出現3’突出端),每個反應建議模板量為1 μg;

    b. 以T7啟動子的PCR產物或合成的DNA片段為模板:PCR擴增模板時將T7啟動子(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)加到非編碼鏈引物的5‘端。PCR產物可以不經純化直接作為轉錄模板,但純化后會產出更多的RNA,每個反應建議模板量為0.5 μg左右。

    2. 轉錄反應:按照表格推薦反應體系在潔凈的EP管中加入各種試劑,充分混勻后于37℃反應2 h。(如合成小于300 nt的RNA,建議將反應時間延長至4 h或更長時間)。

    Component

    Volume

    Template

    0.5-1 μg

    5×T7 Transcription Reaction Buffer

    4 μL

    25 mM NTP Mix

    2 μL

    T7 RNA Transcription Enzyme Mix

    4 μL

    Nuclease Free Water

    To 20 μL

    3. 反應完畢后向體系中加入1 μL DNase I,37℃反應15 min,消化轉錄的DNA模板。

    4. 轉錄合成的RNA經電泳分析、純化后,可用于下游實驗。

    5. 轉錄產物定量、檢測:通過紫外吸收法可以測定RNA濃度(游離核苷酸會影響定量的準確性,RNA產物需要純化);電泳檢測推薦采用1%甲醛瓊脂糖變性膠檢測,電泳液為1×MOPS Buffer(10×MOPS Buffer:0.4 M MOPS,pH 7.0,0.1 M Sodium Acetate,10 mM EDTA)。凝膠制備方法:稱取0.5 g瓊脂糖加入36 mL RNase-Free Water中,加熱溶化后,加入5 mL 10×MOPS Buffer。待溶液冷卻至不燙手時,加入9 mL甲醛溶液(37%),混勻后倒膠。電泳檢測時取適量RNA與RNA Loading Buffer混合,70℃孵育10 min后冰浴2 min,全部點樣。電泳結束后用EB或SerRed染色觀察。


    注意事項

    1. 人體皮膚表面含有豐富的RNase,實驗時請帶好實驗手套、口罩,實驗耗材無菌無酶,防止RNase污染。

    2. 如需制備標記RNA,請替換試劑盒中的NTP Mix。

    3. 試劑盒中對照模板轉錄長度為500 nt。

    4. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

     

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