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    原代細胞的復蘇步驟

    來源:萬物生物   發布時間:2020-12-10

    細胞一般儲存在液氮中,溫度達-196℃,理論上儲存時間是無限的。細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融,實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。

      細胞復蘇就是要把原本冷凍保存(凍存)著的細胞恢復到一般的生長狀態,今天我們來看看原代細胞的復蘇步驟。

      一、檢查

      收到細胞株包裹時,請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形,若有請立即處理告訴寄方。細胞株請盡速開始培養,或立即冷凍保存(置于–70 °C,隔夜后,移到液氮罐保存)。

      二、冷凍細胞解凍 

         方法一:

    1、準備好37度水浴鍋,預熱至37度;

    2、準備好T25培養瓶,加入10ml完全培養基(培養基量必須大于凍存液10倍體積);

    3、取出凍存細胞管,用一次性PE手套包裹凍存管(防止管內進水導致污染),迅速放于水浴鍋內,于1min內融化完全;

    4、取出凍存管,酒精噴灑消毒后擦干,置于超凈臺內;

    5、吸取凍存管內細胞懸液,加入步驟2中準備好的T25培養瓶內,8字緩慢搖勻;

    6、培養瓶放于37度CO2恒溫培養箱內,靜置培養24h,更換新鮮換培養基(注意貼壁細胞、懸浮細胞不同操作方法)。

         方法二:

    1、準備好37度水浴鍋,預熱至37度;

    2、準備好15ml無菌離心管,加入10ml完全培養基(培養基量必須大于凍存液10倍體積);

    3、準備好實驗用培養板或培養器皿;

    4、取出凍存細胞管,用PE手套包裹凍存管(防止管內進水導致污染),迅速放于水浴鍋內,于1min內融化完全;

    5、取出凍存管,酒精噴灑消毒后擦干,置于超凈臺內;

    6、吸取凍存管內細胞懸液,加入步驟2中準備好的15ml無菌離心管,輕輕吹打混勻;

    7、將離心管內細胞懸液,按實驗需求接種于實驗器皿內(注意接種密度不低于2×104/cm2),放于37度CO2恒溫培養箱內,靜置培養24h,更換新鮮換培養基(注意貼壁細胞、懸浮細胞不同操作方法)?! ?/span>

      三、細胞復蘇注意事項

    1、整個復蘇過程要盡量快,溶解時間太長可能影響復蘇效果;

    2、已溶解的凍存細胞盡量短時間的在常溫存放,盡快稀釋或者離心去除DMSO;

      3、由于“化冰”這一步里凍存管與水溫差太大,尤其是液氮里拿出來的凍存管,放到水里可能會造成翻江倒海的既視感,所以可以用鑷子夾住凍存管往水里摁,這樣即使有炸裂的情況也會有水做緩沖;

      4、取凍存管時要謹防凍傷,尤其是夏天,盡管熱也最好穿長袖白大褂;

      5、離心這一步也可以在凍存管里的冰融化后直接進行,也就是直接把凍存管離心,離心后棄去原來的凍存液,然后直接加完全培養基重懸細胞,接著把細胞轉到培養皿/瓶里培養。這種方法也許不能將DMSO清除得很干凈,但是基本影響不大;

      6、 復蘇第二天記得去看看細胞,如果狀態還不錯的話就說明復蘇成功。

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