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    Western免疫印跡(Western Blot)

    來源:萬物   發布時間:2021-08-31

    Western免疫印跡(Western Blot)是將蛋白質轉移到膜上,然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白,可用相應抗體作為一抗進行檢測,對新基因的表達產物,可通過融合部分的抗體檢測。

    一、 原理
    Southern或Northern雜交方法類似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質,“探針”是抗體,“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。 該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。 
    二、WB技術操作步驟:
    1 樣品準備
    1)分別取大約200mg組織加入液氮碾磨成粉末狀,按每200mg組織加900μl上樣Buffer(無溴酚藍)和100ul 10mg/ml PMSF,混勻,玻璃勻漿器冰點勻漿;
    2)4℃,12000rpm離心10min;
    3)取上清夜-70℃凍存24hr;
    4)4℃ 12000rpm再次離心10min,取上清分裝,一份用于定蛋白,另一份加入溴酚藍(0.1%(W/V))后于100℃加熱4min,后于-20℃保存待用。
    2 定蛋白及計算電泳上樣量
    根據總蛋白測定試劑盒說明書操作測定樣本中的總蛋白含量,電泳上樣量定為40ug
    3 電泳
    1)安裝好電泳裝置;
    2)根據不同的指標配制相應濃度的分離膠,灌膠約3/5體積,液封(<10%用0.1%SDS,>10%用異丙醇);
    3)30min后,待凝后傾去封液;
    4)配5%的濃縮膠,灌膠至距平板頂部2mm處,插入梳子, 30min后,待凝后拔出梳子,用去離子水清洗加樣孔,用濾紙吸干;
    5)上樣:各樣品取50ug上樣,marker取10μl上樣(上樣前需按說明書進行預處理);
    6)緩慢加入內、外槽緩沖液,接通電源,90v電泳至指示劑進入分離膠后,調電壓至150V繼續電泳;
    7)當指示劑距平板底端1cm處時停止電泳;
    4 轉膜及檢測
    1)準備2個12cm的平面皿,一個裝去離子水浸泡NC膜20min,另一裝轉移緩沖液浸泡海綿和濾紙20min;
    2)取下膠,切除濃縮膠部分后,將分離膠浸入轉移緩沖液中約5min;
    3)按順序安裝好轉膜裝置(黑色板-海綿-三層濾紙-凝膠-硝酸纖維膜-三層濾紙-海綿-紅色板);
    4)完全排除氣泡, 4℃,100mA轉膜2h;
    5)傾去轉膜緩沖液,拆除轉膜裝置,將硝酸纖維膜放入麗春紅中搖床染色15min,用去離子水清洗至能看到條帶,后用鉛筆標出marker位置,再用去離子水震蕩以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右;
    6)將膜轉移至另一容器中,用5%脫脂奶粉封閉, 4℃過夜;
    7)將膜轉移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的一抗;
    8)37℃搖床孵育約2h;
    9)PBST洗滌4次,每次5min;
    10)將膜轉移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的二抗,37℃搖床孵育約30min;
    11)PBST洗滌4次,每次5min;
    12)將膜轉移至盡可能小的容器中并加入BCIP/NBT底物,室溫孵育30min;
    13)取出NC膜,用蒸餾水漂洗后晾干;
    14)掃描及分析。
    三、 注意事項
    1、 一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經過預實驗確定最佳條件。
    2、 顯色液必須新鮮配置使用,最后加入H2O2。

    3、 DAB有致癌的潛在可能,操作時要小心仔細。

    4、客戶要確保檢測樣本沒有問題。


    5、客戶要確??贵w的有效性。
    6、實驗周期比較緊張的客戶需特別說明。
    7、收費標準:以每張膜8個樣本收費,不足8個樣本的按8個樣本收費)



    四、萬物生物|WB實驗周期:
    接受樣本后,1-2個月。



    五、萬物生物|WB實驗注意事項:
    1、客戶要確保檢測樣本沒有問題。
    2、客戶要確??贵w的有效性。
    3、實驗周期比較緊張的客戶需特別說明。
    4、收費標準:以每張膜8個樣本收費,不足8個樣本的按8個樣本收費)



    六、萬物生物|WB服務結果提供:
    1、目的蛋白實驗圖片。
    2、灰度分析結果。(免費分析)
    3、內參結果。(免費跑膠)
    4、詳細的實驗步驟。


    5、免費提供蛋白樣本保存液。





    結果展示




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