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    酶聯免疫吸附(ELISA)實驗

    來源:萬物   發布時間:2021-08-31

    酶聯免疫吸附(ELISA)實驗

           酶免疫測定(enzyme immunoassay, EIA)或免疫酶技術(immunoenzymatic technique)是指用酶標記抗體或酶標記抗體進行的抗原抗體反應。它采用抗原與抗體的特異反應與酶連接,然后通過酶與底物產生顏色反應,用于定量測定。

           酶聯免疫吸附(ELISA)可以:(1)免疫酶染色各種細胞內成份的定位。(2)研究抗酶抗體的合成。(3)顯現微量的免疫沉淀反應。(4)定量檢測體液中抗原或抗體成份。

           目前常用的方法稱為酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),其方法簡單,方便訊速,特異性強。

           ELISA是由抗原(抗體)先結合在固相載體上,但仍保留其免疫活性,然后加一種抗體(抗原)與酶結合成的偶聯物(標記物),此偶聯物仍保留其原免疫活性與酶活性,當偶聯物與固相載體上的抗原(抗體)反應后,再加上酶的相應底物,即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。其所生成的顏色深淺與欲測的抗原(抗體)含量成正比。


    實驗方法

    1.標準品的加樣:設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;。

    2.加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
    3.加酶:每孔加入酶標試劑100μl,空白孔除外。
    4.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
    5.配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
    6.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。
    7.顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.
    8.終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。

    9.測定:以空白孔調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。




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