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    CRISPR/Cas9基因敲除

    來源:萬物   發布時間:2021-08-31

    CRISPR/Cas9基因敲除

    CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一種來自細菌降解 入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。在細菌及古細菌中,CRISPR系統共分成3類,其中類和類需要多種CRISPR相關蛋白(Cas蛋白)共同發揮作用,而類系統只需要一種Cas蛋白即可,這為其能夠廣泛應用提供了便利條件。

    目前,來自StreptococcuspyogenesCRISPR-Cas9系統應用最為廣泛。Cas9蛋白(含有兩個核酸酶結構域,可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNAtracrRNA結合成復合物,然后通過PAM序列結合并侵入DNA,形成RNA-DNA復合結構,進而對目的DNA雙鏈進行切割,使DNA雙鏈斷裂。 由于PAM序列結構簡單(5’-NGG-3’),幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點,因此得到廣泛的應用。CRISPR-Cas9系統已經成功應用于植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞,是目前最高效的基因組編輯系統。

    通過基因工程手段對crRNAtracrRNA進行改造,將其連接在一起得到sgRNAsingleguideRNA。融合的RNA具有與野生型RNA類似的活力,但因為結構得到了簡化更方便研究者使用。通過將表達sgRNA的原件與表達Cas9的原件相連接,得到可以同時表達兩者的質粒,將其轉染細胞,便能夠對目的基因進行操作。

    作為一種新的基因編輯技術,CRISPR/Cas9有以下特點和優勢

    1、靶向精確性更高。RNA靶向序列和基因組序列必須完全匹配,Cas9才會對DNA進行剪切。

    2、可實現對靶基因多個位點同時敲除。

    3、實驗周期短,最快僅需2個月,節省大量時間和成本。

    4、無物種限制。

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