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    雙熒光素酶報告基因檢測

    來源:萬物   發布時間:2021-08-31

    雙熒光素酶報告基因檢測

    一、檢測原理

    全基因合成miR潛在結合位點上下游~500bpLncRNA、circRNAmRNA3UTR)野生形式WT及結合位點的突變形式Mut,克隆到psiCHECK-2多克隆位點處(1640-1674)(圖1),然后與miRmimics/NC共同轉染293T細胞測定熒光素酶讀值即可。

    二、載體構建與Mimics合成

    1、構建WT miR潛在結合位點到psiCHECK-2載體,命名為WT;

    2、構建Mut miR潛在結合位點到psiCHECK-2載體,命名為Mut(突變模式:A/TG/C互變);

    3、合成待測miRMimmics及陰性對照NC。

    三、 實驗分組信息



    psiCHECK- Target 序列

    miR

    Target-1

    1

    WT

    NC

    2

    WT

    Mimics

    3

    Mut

    NC

    4

    Mut

    Mimics

    Target-2

    1

    WT

    NC

    2

    WT

    Mimics

    3

    Mut

    NC

    4

    Mut

    Mimics

    四、具體實驗步驟:

    (細胞轉染操作步驟

    1、事先準備好用于轉染的分到96孔板中的293T 細胞和目的質粒,待細胞密度達到50%-70%為宜。

    2、10 ml DMEM0.16 mglncRNA (circRNA/3’UTR)/Mut目的質粒以及5 pmolmiR/Negative.ControlN.CMimics充分混勻后室溫放置(溶液A);然后將10 ml DMEM0.3 ml 的轉染試劑(轉染試劑為漢恒生物產品LipoFiter,濃度為0.8 mg/ml)充分混勻(溶液B),室溫放置5 min。

    3、將溶液A與溶液B充分混勻,室溫放置20 min。

    4、轉染前為細胞換取新鮮培養基,之后將轉染混合物加入混勻。37℃,5% CO2培養。

    5、轉染6 h后換取新鮮培養基,轉染48 h后收集細胞檢測。

    (檢測實驗操作步驟

    檢測試劑盒:Promega Dual-Luciferase system

    1、將5′PLB (Passive Lysis Buffer)用蒸餾水稀釋至1′PLB,以96孔板每孔100 ml的量加入,用移液槍吹打打散細胞,置于室溫搖床上緩慢搖15分鐘后,將細胞裂解液吸至1.5 ml離心管,412000 rpm 13200g)離心10 min,取上清移入新的管子;

    2、96孔板中加入Luciferase Assay Reagent II (LAR II)( Luciferase Assay Reagent, Progema)工作液100 ml;

    3、加入20 ml細胞裂解液,移液槍吹打混勻2-3次,測定記錄Firefly luciferase值,此值為內參值。

    4、加入100 ml Stop & Glo? Reagent(Luciferase Assay Reagent, Progema),移液槍吹打混勻2-3次,測定記錄Renilla luciferase值,此即為報告基因發光值。

    五、 預期實驗結果



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