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    細胞系細胞株培養構建

    來源:萬物   發布時間:2021-08-31

    1.細胞系

    細胞系(cell line)指原代細胞培養物經首次傳代成功后所繁殖的細胞群體。 也指可長期連續傳代的培養細胞。因此,細胞系狹義的是指可連續傳代的細胞,廣義是指可傳代的細胞。

    2.細胞株

    通過選擇法或克隆形成法從原代培養物或細胞系中獲得具有特殊性質或標志物的培養物稱為細胞株(CellStrain),也就是說,細胞株是用單細胞分離培養或通過篩選的方法,由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特殊性質或標志必須在整個培養期間始終存在。

    3.細胞培養

    細胞培養(cell culture)是指在體外模擬體內環境(無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養條件等),使之生存、生長、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養也叫細胞克隆技術,在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。細胞培養技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞,這是克隆技術必不可少的環節,而且細胞培養本身就是細胞的克隆。細胞培養技術是細胞生物學研究方法中重要和常用技術,通過細胞培養既可以獲得大量細胞,又可以借此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。

    4.基本過程

    細胞低溫凍存是培養室常規工作和通用技術。細胞凍存在-196℃液氮中,儲存時間幾乎是無限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融。

    1. 凍存細胞

    1)選對數增生期細胞(證明無支原體污染),在凍存前1d換液。

    2)按常規方法把培養細胞制備成懸液,計數,使細胞密度達5×107/ml左右密度,離心,去上清。

    3)加入配制好的凍存液(培養液6.8ml,小牛血清2ml,DMSO 1ml,5.6%NaHCO3 0.1ml),按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養液中加入保護劑10%二甲基亞砜(DMSO) 或甘油,可使冰點降低,使細胞內水分在凍結前透出細胞外。

    4)分裝于無菌凍存管中,每管加1.5m懸液。

    5)旋好凍存管并仔細檢查,一定要蓋緊,做好標記。

    6)凍存:在特殊的儀器或簡易的液氮容器中,按-1℃/min的速度,在30~40min時間內,下降到液氮表面,再停30min后,直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度,過快能影響細胞內水分透出,太慢則促進冰晶形成。

    操作時應戴防護眼鏡和手套,以免液氮凍傷。

    2. 復蘇細胞

    1)從罐中取出凍存管。

    2)迅速放入36℃~37℃水浴,不時搖動,使其急速融化,30~60s內完成。

    3)凍存管用70%酒精擦拭消毒后,打開蓋子,用吸管將細胞懸液注入離心管中,再滴加10ml培養液。

    4)低速離心(500~1000r/min) 5min,去上清后再用培養液洗一次。

    5)用培養液適當稀釋后,裝入培養瓶37℃培養,次日更換一次培養液后,繼續培養。以后仍按常規進行培養。

    凍存細胞數量要充分,密度應達到107/ml,在融后稀釋20倍時,仍能保持5×105/ml數量

    3.傳代培養

    1)吸掉或倒掉培養瓶內舊培養液。

    2)向瓶內加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養瓶底為宜。

    3)置37℃孵箱或室溫(25℃溫度)下進行消化,2~5min后把培養瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察,當發現胞質回縮、細胞間隙增大后,應立即中止消化。

    4)吸出消化液,向瓶內加入Hanks液少量,輕輕轉動培養瓶,把殘留消化液沖掉,然后再加培養液。如果僅使用胰蛋白酶消化,在吸除胰蛋白液后,可直接加入少量含血清的培養液,終止消化。

    5)使用彎頭吸管,吸取瓶內培養液,按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞,使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔,以防用力過猛損傷細胞。

    6)用計數板計數后,分別接種于新的培養瓶中,置CO2培養箱中進行培養。

    7)細胞培養換液時間應根據細胞生長的狀態和實驗要求來確定。一般2~3d后應換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面,即可使用;也可繼續傳代擴大培養或換成維持液。

    5.注意事項

    1)防止細胞交叉污染。

    2)細胞污染的預防。


                      


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